生平

萬曆四十年（1612年）壬子科應天鄉試舉人，萬曆四十一年（1613年）聯捷癸丑科進士，授福州府推官，任內「政肅民和、豪強屏跡」，後來又升吏部文選司員外郎，謝絕請託，秉公辦事。為官以來以正直清廉，疾惡如仇而聲名在外。

天啟五年（1625年）魏大中被宦官魏忠賢陷害逮捕，路過蘇州吳門時，順昌親詣其船，要將女兒許配給大中之孫。抻解囚犯的旗尉趕忙催促上路，順昌破口大罵：「你不知道世間有不怕死的男子漢麼？回去告訴魏忠賢，我就是以前的吏部郎周順昌！」魏忠賢自恨之，而魏忠賢的義子倪文煥，也趁機彈劾周順昌與魏大中家通婚，並且誣告周貪污鉅款，周順昌於是被革職，但是魏忠賢仍未息怒。

應天巡撫周起元罷官，周順昌曾作文送他，文章有斥責魏忠賢閹黨之語。天啟六年魏忠賢假蘇杭織造太監李實誣攀，將順昌下錦衣衛鎮撫司詔獄。逮捕時激起蘇州人民反感，由於周順昌平日有德於民，上萬民眾上街爭奪周順昌，兩名東廠錦衣衛被當眾打死，後來五位民眾出面頂罪，避免蘇州居民被官府法辦，也被處死。復社領導人張溥《五人墓碑記》就是紀念這五人的作品。

順昌在獄中被錦衣衛許顯純拷打，要求他交出贓款三千兩銀，牙齒盡落，負責拷問的顯純問道「復能罵魏上公否？」，周順昌把滿口鮮血噴到許顯純臉上，駡聲更厲。許顯純只好半夜偷偷殺了順昌，年四十三。

身後

崇禎元年（1628年），崇禎帝追究閹黨，忠賢畏罪自殺，順昌追贈太常寺卿，諡忠介，加封其一個兒子。。有二子：長子周茂蘭（字子佩）及次子周茂藻（字子潔）皆為復社成員。周順昌侄女為明末清初醫者蔣示吉母。

明末清初戲曲家李玉與葉時章、朱素臣及畢魏等合著《清忠譜》以周順昌反抗魏忠賢而引發蘇州抗議事件而作。